T4 DNA连接酶催化契合的双链DNA或RNA的5′-磷酸末端和3′-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。

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采用大肠杆菌表达来源于T4噬菌体的RNA Ligase基因，是一种ATP-依赖的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。

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