技术干货|MeRIP-qPCR方法及应用细谈-技术前沿-资讯-生物在线

m6A等RNA修饰的主要研究手段是通过MeRIP方法对发生修饰的片段进行富集，其后进行高通量测序分析修饰位点。而无论是一篇仅展示修饰位点分布特点的谱学文章，还是深入研究修饰调控基因表达机制的文章，在高通量测序这一步之后，通常都需要对筛选出来的部分修饰位点进行低通量的MeRIP-qPCR验证。这个实验说来简单却必不可少，对于刚刚接触RNA修饰研究的小伙伴来说，可能会对MeRIP-qPCR的方法原理、结果含义、展示方法等有一些疑问，而看文章中又常常是几句话带过，无法解答心中的困惑，看过仍然对自己手里的数字一头雾水。这次我们就在这里详细谈一谈MeRIP-qPCR相关问题。

1.MeRIP-qPCR的目的是什么？
首先我们需要明确的是，MeRIP-qPCR的目的是验证某个目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平。
得到的结果往往是一个%（IP/Input）的数值，它体现的是该位点的修饰水平（可以大致理解为：这个转录本表达了很多条，其中百分之多少是这个位点有修饰的？）需要与普通qPCR验证基因表达水平（可以大致理解为：这个转录本表达了多少条？）的目的区分开。

2.MeRIP-qPCR的实验方法？
MeRIP-qPCR就是MeRIP实验后进行一个qPCR。
这里的MeRIP实验同MeRIP-seq测序中的其实相同：对RNA进行片段化。然后每个样品一分为二，一部分片段用针对该修饰的特异性抗体与RN**段进行免疫共沉淀(IP)，留为IP样品，另一部分不进行IP直接留作Input样品。之后对两部分RN**段分别进行逆转录和qPCR。如果是测序，就是在这里把紧接的qPCR改为接建库测序。

3.MeRIP-qPCR引物如何设计？
由于目的是定量位点的修饰水平，因此MeRIP-qPCR的引物不仅是针对目标基因，还要是针对其上的那个修饰位点（区域）。这个位点信息可以从：
（1）MeRIP-seq的测序结果中筛选得来
通常是一段位置坐标，比如云序生物提供的MeRIP-seq结果，某个甲基化峰位置如：chr1:111234-111567。有了这个位置信息，可以去UCSC genome browser网站:
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway选对应的基因组版本获取这段序列。

（1）MeRIP-seq的测序结果中筛选得来

（2）网站预测得到
如果没有测序，想先通过MeRIP-qPCR看看关注的某基因上是否可能存在修饰，就只能预测一下发生修饰概率高的区域位置。通常这些网站是基于研究公认的该种修饰motif序列等进行预测，需要将目标RNA的序列输入，可生成预测结果。
m6A RNA甲基化预测网站：
http://www.cuilab.cn/sramp/
m5C RNA甲基化预测网站：

http://www.rnanut.net/rnam5cfinder/

4.MeRIP-qPCR为什么没有内参基因？
（1）MeRIP-qPCR不需要内参来进行样本间的均一化矫正
从结果的形式%（IP/Input）我们也可以看到，这个实验侧重看修饰的片段（IP样品qPCR结果）占总片段（Input样品qPCR结果）的比例，实验目的只是要得到这两者的比值就体现修饰水平，因此MeRIP-qPCR不涉及到普通的相对定量qPCR需要的内参：
内参是衡量不同样品间表达量时用来均一化样品的，比如默认GAPDH在你的各个样本之间表达量应当相同，qPCR结果样品A中目的基因表达量1，GAPDH表达量10；样品B中目的基因表达量1.5，GAPDH表达量15，那么不能说因为1<1.5所以就说A样品目的基因表达量低，因为从GAPDH来看可能只是实验某环节中A样品的量整体少了一些而已。而是要看A中目的基因表达量是GAPDH的0.1倍，B也是0.1倍，两样品中目的基因表达量其实无差别。
换做MeRIP-qPCR中，如果针对目的基因目的位点qPCR，样品A的IP结果0.2，Input结果1；样品B的IP结果0.3，Input结果1.5，我们的%（IP/Input）结果显示两个样品甲基化水平数值都是0.2，修饰水平无差异，到此就完成了目的。
有人问那没有做内参，万一发生如上段提到的样品用量等环节有差异，会不会影响修饰水平的比较？显然，如果两个样品本来修饰水平相同，那么夸张地想，即使B样品用量由于手抖加了A的10倍，qPCR结果也会IP和Input信号都增长10倍，不影响这个比值即修饰水平。

（2）没有公认在不同样品中修饰水平都会稳定的基因可做参照
前面第1点主要从多个样品比较的角度解释了MeRIP-qPCR为何不需要内参基因。
而有时出现以下情况：1）没有分组对比，只想看下这一个（组）样品中该基因算不算有修饰，此时有个疑问：结果的%（IP/Input）达到多少可算作有修饰？——回答是目前没有一个定值。那么此时难免会希望能有个已知有修饰的参考基因，我们的目的基因如果水平接近或者超过就算有修饰。2）想看看MeRIP实验体系有没有问题，做个已知有修饰的基因当阳性对照看看效果。然而RNA修饰是一个动态的可逆的酶促反应，在同个组织细胞中的水平可能都会随着环境千变万化，不同组织中更是差别很大，与普通qPCR检测基因表达时能找到稳定表达的看家基因不同，MeRIP-qPCR没有一个稳定修饰的基因做参照，目前RNA修饰文章也都不要求有这种参照。
针对上述目的1），可以同时多做一个非特异性IgG抗体的免疫沉淀富集，对比样品本身的IP和IgG是否有显著差异，放在文章中作为该位点有一定程度的修饰的证据。
针对目的2），也可做IgG对照检测体系的特异性。除此之外，云序生物代理的GenSeq m6A MeRIP试剂盒中除了提供了IgG抗体，还提供了一对m6A的阳参和一对阴参引物，是根据文献报道的，靶向 HEK293 细胞中 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Positive Primers）和无 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Negative Primers），供有条件且感兴趣的用户验证实验效率和抗体特异性。但如前面所说，m6A 修饰具有很强的细胞类型特异性，无法保证在任何细胞系或样品中，该引物都能作为很好的参照。因此，建议想对实验体系进行进一步自验证的用户，采用 HEK293 细胞的 RNA 进行验证实验。

5.MeRIP-qPCR不能看出基因表达量？
有人想：Input样品又没经过IP，qPCR操作不就与普通qPCR没什么差别，那么做了MeRIP-qPCR，不能得到基因表达量的结果吗？比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B样品Input分别是1和1.5的结果可以用来看一下这个基因在两样品中的表达量有没有差异？——我们不知道，因为没有GAPDH等内参基因来计算，要看表达量的话就不知道1和1.5的差异是否是如前一段那样由于用量差异等因素带来的了。因此通常说起MeRIP-qPCR，结果不能用来体现基因表达量。
那如果在MeRIP-qPCR步骤中直接多扩增一个GAPDH基因，与目的基因Input联合在一起定量表达量是否可行？我们只能说可以参考，不过由于MeRIP实验是有片段化这一步骤的，PCR信号会弱一些，对于验证表达量的目的来说还是推荐采用常规的qPCR步骤会更准确、风险更小。

6.IP/Input/IgG傻傻分不清：我需要做哪些、如何展示？
前面1.和2.两个环节谈到过，IP是用该修饰的特异性抗体，通过免疫共沉淀富集带修饰的片段，Input是不进行富集的所有片段，这两个是MeRIP-qPCR必做的，每个样品分别做了这两部分的PCR结果合起来计算才能体现修饰水平，达到实验的目的。而IgG如4（2）提到，是用非特异性抗体，通过免疫共沉淀富集非特异性结合的片段，作为对IP的对照，证明IP的信号不是源自抗体非特异性和，而是确实是针对发生修饰的片段。IgG可以选做。MeRIP-qPCR结果通常用柱状图展示即可，常见的如以下3种情况：
（1）只做IP和Input：展示%（IP/Input）值
如果有两组样品，展示一个目的基因在两组的修饰水平。或者一组样品，展示多个基因的修饰水平差异，可以只做IP和Input，展示%（IP/Input）值。[1][2]

*为了便于直观体现组间的比较，有时会将所有%（IP/Input）数值统一除以第一组样品或第一个基因的%（IP/Input）数值，使柱状图中第一组样品或第一个基因的柱高是1，相当于全部以第一组样品或第一个基因为基准展示相对修饰水平。经这种处理后通常纵坐标会称为relative enrichment、relative level.[3][4]

（2）做IP、IgG和Input：展示%（IP/Input）值、%（IgG/Input）值
如果为了严谨的证明实验体系没有问题，或者验证指标只有一个分组/一个基因但需要一个对照，可以同时多做一个IgG，结果展示%（IP/Input）和%（IgG/Input）两个柱子对照。[5][6]

（3）做IP、IgG和Input：展示Fold enrichment值（%（IP/Input）和%（IgG/Input）的比值）
如果做了IgG对照，还可以选择用Fold Enrichment来展示，富集倍数%(IP/Input)/%( IgG/Input)，即IP比对照的IgG信号高多少倍，也可以用来体现修饰的水平。通常是分组和基因都是多个时不想一一单独展示IgG。[7]

*以上图参考文献：

[1] Liu, L. , Wang, J. , Sun, G. , Wu, Q. , & Pan, Q. . (2019). M6a mrna methylation regulates ctnnb1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Molecular Cancer, 18(1).

[2] Tong, J. , Wang, X. , Liu, Y. , Ren, X. , Wang, A. , & Chen, Z. , et al. Pooled crispr screening identifies m 6 a as a positive regulator of macrophage activation. Science advances, 7(18), eabd4742.

[3] Yin, H. , Zhang, X. , Yang, P. , Zhang, X. , & Zhang, R. . (2021). Rna m6a methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming. Nature Communications, 12(1).

[4] Yang, X. , Shao, F. , D Guo, Wang, W. , & Lu, Z. . (2021). Wnt/β-catenin-suppressed fto expression increases m6a of c-myc mrna to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis. Cell Death & Disease, 12(5).

[5] Wang, W. , Shao, F. , Yang, X. , Wang, J. , & Lu, Z. . (2021). METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding. Nature Communications.

[6]Chen, C. , Liu, W. , Guo, J. , Y Liu, & Gao, S. . (2021). Nuclear m6a reader ythdc1 regulates the scaffold function of line1 rna in mouse escs and early embryos. Protein & Cell(7849).

[7] Zhou, B. , Liu, C. , Xu, L. , Yuan, Y. , & Ma, X. . (2020). N 6 -methyladenosine reader protein ythdc2 suppresses liver steatosis via regulation of mrna stability of lipogenic genes. Hepatology.

7.MeRIP-qPCR结果的计算？
MeRIP-qPCR结果计算如下表:

*其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品，由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多，IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同，因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化RNA用来作为Input样品qPCR得到Ct值B1，则%(IP/Input)=2(B1-A1)*（3/15）*100。IgG/Input的计算也是同理。

云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6ARNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
● m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
● m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
● m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
● m6A mRNA测序
● m6A miRNA测序
02 检测整体m6ARNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

云序生物服务优势
优势一：发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表52+篇高水平文章，合计影响因子450分+，是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二：至今完成4000+例 m6A测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：独家提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：国内最全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。

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