第二期 | 细胞工厂扩大化培养之操作手册篇-产品资讯-资讯-生物在线

第二期 | 细胞工厂扩大化培养之操作手册篇

作者：无锡耐思生命科技股份有限公司 2023-03-17T12:32 (访问量:2773)

——大规模细胞培养——

细胞工厂升级剧集片

第二期

上期说到，耐思细胞工厂是一种设计精巧的细胞培养装置，可用于如细胞与基因治疗、疫苗或干细胞领域等工业规模生产，适合于贴壁细胞培养，线性放大不会改变细胞生长的动力学条件。

细胞工厂在各行各业究竟起到了什么样的作用呢？

细胞工厂应用于哪个阶段呢？

如何操作才能发挥细胞工厂的价值呢？

细胞工厂扩大化培养之操作手册篇

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一、应用方向

01 细胞与基因治疗

细胞与基因治疗是指载体治疗，是一种将外源遗传物质导入靶细胞、修饰或操纵基因的表达、改变细胞的生物学特性，从而达到治疗效果的新兴治疗方式。

如何将目的基因或者细胞安全有效地传送到人体内成为这一疗法需要突破的重要瓶颈。一般需要借助病毒作为载体，如腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒。

以研发为目的的小规模生产是采用生长在培养皿、培养瓶、细胞工厂的贴壁细胞。当转向临床实验时会需要大量的慢病毒载体，这个时候就需要用到细胞工厂，一般10层细胞工厂应用较多。

02 疫苗产业

疫苗在人类疾病防控中具有不可替代的作用，如何实现疫苗经济、高效且安全的大规模生产，一直是业内考虑的重点。

随着生物技术的持续创新发展，疫苗种类呈现多元化发展态势，除了灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗等我们熟知的类型外，病毒载体疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等新型疫苗陆续出现。

目前，细胞工厂已广泛应用于新冠疫苗、口服脊髓灰质炎灭活疫苗[1]、冻干甲型肝炎减毒活疫苗[2]、麻腮风疫苗[3]、口服轮状病毒活疫苗[4]、水痘疫苗[5]等的工业化生产。

03 干细胞领域

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。根据美国临床试验数据库clinicaltrials.gov显示，目前全球与间充质干细胞相关的临床试验有1300多项，已获批上市的干细胞新药14款。利用细胞工厂进行间充质干细胞、多功能干细胞的工艺放大，是干细胞研究中的重要步骤。

二、操作手册

01正确操作步骤

常规十层细胞工厂操作方法

1. 将准备好的培养基倒入细胞工厂。（建议每层加入的体积为150-200mL）

2. 将细胞工厂侧放，使液面平衡。

3. 液口朝上，静置后培养液平均分配到每一层。

4. 缓慢将细胞工厂放至水平位置。

5. 放入细胞培养箱中孵育培养。

带管路十层细胞工厂操作方法

1.将进液管路上的轧带剪掉。

2.根据需求可在进液管路上加上管夹，将进液管路末端和储液瓶的出液管路通过无菌接管机进行连接。

3.加入细胞悬液，将进液管路上的管夹关闭。储液瓶中的培养基或细胞悬液可利用重力虹吸原理或使用蠕动泵将细胞悬液加入到细胞工厂，操作过程中尽量避免产生气泡。

4.将细胞工厂侧放，使液面平均分配到每层，进液管路侧朝下，空气滤器侧朝上，避免液体进入到空气滤器中。

5.顺时针旋转90℃，使加液口朝上，静置后液体平均分配到每一层。

6.缓慢将细胞工厂放至水平位置,整理好进液管路，然后放入细胞培养箱中孵育培养。

注意事项：

1.请提前将细胞工厂和培养基预热至培养温度∶由于大的培养器要达到设定的培养温度需要很长时间，所以在实验开始前，将细胞工厂和培养基预热至培养温度，可加快细胞贴壁，并显著提高细胞回收率。

2.请缓慢操作，避免大幅晃动产生气泡∶ 气泡可能导致培养基从上层流到下层。

3.避免酒精喷洒到透气盖上，酒精可能会湿润疏水滤膜，导致不能透气影响气体交换或导致操作时不能平衡压力。

02观察细胞方法

一般使用倒置显微镜对细胞工厂中细胞的存活率和生长状况进行监测。细胞工厂中各层之间或同一层之间的培养环境基本相同，因此可以通过观察底部一两层或同一层之间的边缘细胞状态，来判断整体细胞工厂中细胞的状态。

常规的倒置显微镜受制于上光源和载物台之间的高度，一般只能用于1层、2层或5层细胞工厂的观察；对于10层的细胞工厂，就需要增加上光源和载物台之间的高度，使其可以适配细胞工厂的高度；对于更大的40层的细胞工厂，人手操作有困难，一般需要大型设备进行电动化、自动化的观察。

03收获细胞指南

1.培养结束后将培养液倒出。

2.使用无钙无镁磷酸盐缓冲液（CMF-PBS）清洗（40-50 mL/层），若有需要重复清洗一次。

3.消化∶消化液（10-40 mL/层）提前预热。

4.收集∶ 1000 rpm 离心5分钟，去除消化液，收集细胞。

5.清洗∶用CMF-PBS或培养基清洗消化过的培养器。

注意事项：

1.确保CMF-PBS完全浸过每层培养面，并轻轻前后晃动细胞工厂，将残留的培养液清洗干净。

2.消化液平均分布到每层，轻轻前后左右倾斜培养器，确保消化液完全浸过培养面，轻轻拍击培养器帮助细胞从表面脱离。

3.对于细胞工厂，由于不能清晰观察中间层的细胞消化状态，建议参照完全相同培养条件下的培养瓶或单层细胞工厂的消化状态。亦可使用专用的多层细胞培养器观察台来观察每层细胞的消化状态。

4.若清洗液或者是细胞工厂培养层存在大量细胞，则需要清洗多次或调整细胞消化的操作。

5.培养温度的一点点偏差都可能影响到细胞的收获率，需密切关注培养的温度是所设定的温度。

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参考文献：

[1]王红燕.张晋.金歌.佟丁丁.沈莉.郑小滨.柯伟华.中国生物制品学杂志,细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用,2014

[2]仲宇航.刘景晔.周妍.孙颖.张立志.战永生.李锐.王云霞.苏宇.预防医学论坛,细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的研究,2012,8

[3]付永其.刘辉.孙雅.宋艳梅.张颖欣.律苗.杨云凯.申亚楠.高静.中国生物制品学杂志,细胞工厂在麻腮风系列疫苗生产中的应用,2018,10

[4]任雅萍.刘学平.庞兴.谢澎.魏至栋.微生物学免疫学进展,细胞工厂生产口服轮状病毒活疫苗的应用研究,2011,4

[5]周翎乔.周锋.孙世杰.彭晓.杨月莲.王亮.谢蕾.马相虎.中国新药杂志,细胞工厂在水痘疫苗生产中的应用,2012,10

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