1. MMC处理后肿瘤细胞PD-L1表达上调

在非细胞毒性浓度下使用几种常规化疗药物将三种NSCLC细胞(A549、H1299和H460)处理48h后，对细胞中PD-L1的表达结果进行评估。结果发现MMC在三种NSCLC细胞中均能够使PD-L1的表达持续增加。为了验证MMC对PD-L1的上调是否是一种普遍现象，在不同癌症类型的更多癌细胞中，对不同浓度和时间的MMC处理进行了探究。在NSCLC和所有测试的癌细胞中，MMC对PD-L1表达的显著上调呈现出了对MMC处理浓度和时间的相关性。

2. PD-L1阻断剂和MMC的结合产生协同抗肿瘤作用

为了确定MMC上调PD-L1表达是否会影响抗肿瘤免疫活性，用MMC预处理H460细胞24h，然后与PBMC共培养24h。结果表明与未用MMC预处理的细胞相比，用MMC预处理的H460细胞细胞裂解数量更多。此外，MMC预处理且PBMCs孵育后的H460细胞CD³⁺T细胞群体中TNF-α水平明显升高。这些结果表明，MMC增强了T细胞的活化。为了验证PD-L1参与MMC和PD-L1联合阻断的增强抗癌作用，作者建立了稳定的PD-L1敲除的PD-L1/KO-H460细胞。通过对PD-L1抗体处理后的Giemsa染色，将进行或未进行MMC预处理过的PD-L1/KOH460细胞和野生型对照H460细胞中T细胞介导的肿瘤细胞杀伤力进行了探究。在野生型H460和PD-L1/KO H460细胞中，MMC和PD-L1抗体的联合作用均明显高于MMC或PD-L1抗体，而在PD-L1/KO H460细胞中观察到了更明显的效果。颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶，可介导细胞毒性T淋巴细胞的凋亡作用。重要的是，与未预处理的H460细胞相比，MMC预处理且PBMC孵育后H460细胞的CD⁸⁺释放出更多的颗粒酶B。为了探究MMC和PD-L1抗体在体内的联合抗癌作用，在C57BL/6小鼠侧翼建立Lewis肺癌模型。当肿瘤体积达到100mm³时，随机的将小鼠进行MMC单独处理，PD-L1抗体单独处理，MMC与PD-L1联合抗体、生理盐水+同型对照IgG腹腔注射处理。与IgG治疗的对照组和其他单药组相比，MMC和PD-L1联合抗体可使得肿瘤生长更加延缓。MMC和PD-L1联合抗体也是四个处理组中存活率最佳的。

3. MMC增加了MHC-I在肿瘤组织中的表达

为了探讨经PD-L1抗体处理后MMC对T细胞反应的增强作用，测定了C57BL/6肿瘤组织中肿瘤浸润T细胞的数量及其活性。免疫组化染色显示，MMC和PD-L1抗体联合处理后CD³⁺和CD⁸⁺T细胞浸润肿瘤的数目明显高于两个单一处理。另外，在联合抗体处理组中T细胞活化标记颗粒酶B也明显增加。为了探讨TILs增加的机理，作者检测了几种参与T细胞活化的共刺激或共抑制分子。肿瘤细胞能够通过下调I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的表达来逃避细胞毒性T细胞介导的特异性免疫反应，这对于识别和随后的杀伤效果是必需的。为此，MMC处理48h后，NSCLC细胞中PD-L1的上调伴随着MHC-I的表达增加。事实上，MMC也被发现NSCLC细胞中MHC-I的表达与MMC处理浓度和时间的增加具有相关性。然而，作者检测了MMC处理后PD-L1和MHC-I在两个正常细胞(HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和NCM460(正常来源的结肠粘膜细胞))中的表达。结果表明PD-L1和MHC-I的表达都没有受到MMC的影响。MHC-I在H1299和H460细胞表面的表达被MMC提高。为了进一步证实这一结果，作者对MMC处理前后患者肿瘤标本中TILs的改变进行了研究。结果表明MMC处理后肿瘤组织PD-L1和MHC-I的表达升高。而在MMC处理后，肿瘤组织中CD³⁺和CD⁸⁺浸润淋巴细胞的数量也明显增加。

4. MMC通过激活p65增加MHC-I的表达

用MMC(0.4μM)处理48h的NSCLC细胞(H1299和H460)中MHC-I mRNA水平显著升高。转录因子NF-κB是细胞对炎症刺激反应的的重要介质。为此，NF-κB p65能够对MHC-I和PD-L1的表达进行调控已被报道。作者探究了MMC处理48h后NSCLC细胞NF-κB p65亚单位表达的影响。结果表明MMC处理后，p65及其磷酸化形式p-p65均增加。荧光素酶报告试验数据表明，p65显著上调了MHC-I和PD-L1启动子驱动的荧光素酶活性。此外，p65的过表达可提高NSCLC细胞中MHC-I和PD-L1的mRNA和蛋白水平。另一方面，p65压制也降低了MHC-I和PD-L1的蛋白表达。为了研究p65对于MMC诱导的MHC-I和PD-L1上调来讲是否是必需的，对p65敲除后的H1299或H460细胞采取MMC处理，然后观察MHC-I和PD-L1的蛋白表达。结果表明虽然在对照细胞中MMC能够诱导p65、MHC-I和PD-L1的表达，但p65的敲除可以减弱MMC对MHC-I和PD-L1的上调的诱导。NF-kB/p65转录的激活需要TNF-α。为了验证MMC诱导的MHC-I和PD-L1上调与p65是否激活的关系，采用MMC或TNF-α处理H460/H1299细胞，检测处理后细胞中MHC-I和PD-L1的p65磷酸化和表达。结果发现SC-75741(一种阻止p65转录活性的抑制剂)能够抑制MMC对H1299和H460中MHC-I表达。相反，在SC-75741存在下，MMC对PD-L1表达的上调没有影响，表明MMC诱导PD-L1表达的上调与p65的转录活性无关。

5. c-JUN的激活使得MMC增加PD-L1的表达

经过MMC处理48h后，NSCLC细胞(A549、H1299和H460)中PD-L1 mRNA水平显著升高。在H1299细胞中PD-L1蛋白稳定性且不受MMC处理的影响。为了研究MMC对PD-L1的转录调控，对具有pGL3-碱性荧光素酶结构的293T细胞进行了荧光素酶报告基因检测，该结构含有4个不同的进行性5’缺失的PD-L1启动子区域。最长的PD-L1启动子序列(p868)在四个启动子区中表现出最高的荧光素酶活性。这一发现表明，PD-L1启动子区域内的核心元素(−762至−587bp)是驱动转录和观察荧光素酶活性的关键。根据PROMO和JASPAR数据库预测少数候选转录因子(包括c-JUN、STAT4和FOXP3)与核心PD-L1启动子元件结合，驱动基因转录。为了进一步证实与PD-L1核心启动子结合并驱动其转录的转录因子(S)的同一性，将表达载体(pCDNA3.1/c-JUN、STAT4或FOXP3)转染293T细胞，用含有核心PD-L1启动子区的荧光素酶构建物(−762至−587bp)重复荧光素酶报告基因检测。结果发现只有pCDNA3.1/c-JUN具有激活PD-L1启动子驱动的荧光素酶活性。此外，当从PD-L1启动子核心启动子区(DeltA)中删除c-JUN结合位点时，PD-L1启动子驱动的荧光素酶活性下降到基线水平。在H460细胞中进行CHIP检测，使用抗c-JUN抗体对PD-L1染色质进行免疫沉淀，发现MMC处理后c-JUN与核心PD-L1启动子区域的关联显著增加。采用同型对照兔IgG作为阴性对照进行免疫沉淀。为了证明CHIP检测的特异性，对c-JUN和RNA聚合酶II与组成型GAPDH启动子的结合与核心PD-L1启动子进行分析。使用正常IgG时，未从免疫沉淀样品中获得PCR信号。用RNA聚合酶II插入染色质检测RNA聚合酶II与GAPDH和PD-L1启动子的结合时，发现c-JUN是与免疫沉淀染色质中的核心PD-L1启动子特异性结合的。研究表明转录抑制剂放线菌素D能够抑制MMC对PD-L1上调的诱导。因此，c-JUN与PD-L1基因启动子结合很可能使得PD-L1表达的转录性上调。为了证实c-JUN作为转录因子起到调节NSCLC细胞中PD-L1基础表达的作用，作者将shRNAs敲除c-JUN。在c-JUN基因敲除的肿瘤细胞中，mRNA和PD-L1蛋白水平均显著降低。作者通过检测处理48h后的A549和H460细胞中c-JUN的表达，进一步探讨了c-JUN在MMC介导的PD-L1表达上调中的作用机理。发现通过MMC处理，mRNA和c-JUN蛋白水平均显著升高。在MMC处理后，激活形式的磷酸盐也显著增加。在c-JUN-敲除的NSCLC细胞(A549和H460)中，MMC对PD-L1上调的诱导消失。

6. C-JUN与它的辅助因子STAT3协调作用使得PD-L1上调

在之前的研究报道中，c-JUN与STAT3相互作用形成一个复合物来调节其靶基因的表达。为了研究STAT3是否参与了MMC诱导的PD-L1上调，检测在MMC处理后的H1299和H460细胞中STAT3的表达。MMC可提高NSCLC细胞中的mRNA和STAT3蛋白水平。在STAT3敲除的细胞中MMC对PD-L1表达的诱导消失。与这个发现一致的是，在硝呋酚酰肼(一种阻止STAT3激活的抑制剂)的存在下，MMC未能上调NSCLC细胞中PD-L1的表达。当p-c-JUN和p-STAT3被转运到细胞核以发挥其转录活性时，来自MMC处理或未处理的H460细胞中的细胞核和细胞质组分被分离和检测。MMC处理后PD-L1细胞质表达升高的同时，细胞质和核中c-JUN和p-c-JUN表达升高。另一方面，在细胞核中STAT3(p-STAT3)的转录活性也上调。另外，MMC处理后H460细胞中c-JUN与STAT3的相互作用增强。表明MMC能调节c-JUN和STAT3的表达和相互作用，从而上调PD-L1在体外的表达。

7. MMC通过ERK信号诱导MHC-I和PD-L1表达

MMC通过激活ERK PD-L1和MMC刺激MHC-I和PD-L1的表达主要通过两个主要机制控制，即IFN-γ依赖和独立的方式。为了验证IFN-γ信号是否参与了MMC对PD-L1表达的上调，对转染对照shRNA或IFNGR1 shRNA的A549和H460细胞进行或不进行MMC处理。在MMC处理后的对照和IFNGR1基因敲除的细胞(A549和H460)中PD-L1、c-JUN、STAT3的表达及其膦酸盐形式均增加。另一方面，虽然IFN-γ能够显著增加PD-L1的表达，但这种作用在IFNGR1基因敲除细胞中消失。因此，MMC处理后PD-L1的增加是由c-JUN/STAT3信号通路介导的，而不是通过IFN-γ依赖性的方式介导的。据报道，MMC通过ERK和JNK信号增加了c-JUN的活性。此外，p65是MAPK通路激活的下游转录因子。因此，MMC对p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平存在影响。在H1299和H460细胞中，MMC均使得ERK和JNK的磷酸化升高。为了进一步阐明ERK和JNK信号的参与，研究了MEK抑制剂(U0126)或JNK抑制剂(SP600125)对MMC诱导的PD-L1和MHC-I表达上调的影响。虽然MMC诱导PD-L1和MHC-I表达不受SP600125的影响，但U0126显著降低了MMC对PD-L1和MHC-I表达上调的诱导。这些发现表明ERK通路的激活在MMC上调NSCLC细胞中MHC-I和PD-L1中起着至关重要的作用。

在本研究中，MMC可上调NSCLC中PD-L1和MHC-I的表达，增强PD-L1阻断剂在体外和体内的疗效，这与肿瘤肿块中TILs的增加以介导抗肿瘤免疫有关。c-JUN的激活和c-JUN与STAT3之间的相互作用增加均通过ERK信号介导PD-L1表达的上调。另一方面，p65的激活也会使得MHC-I增加。综上所述，本研究倡导将PD-L1抗体与MMC进行结合以提高PD-1/PD-L1免疫治疗NSCLC的治疗效果。