基本信息
题目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
合作技术：EMSA
研究背景
抗坏血酸（AsA）是一种抗氧化剂，可以清除植物在胁迫条件下产生的活性氧。本文通过酵母单杂交技术、瞬时表达和EMSA实验验证了SlHZ24和SIGMP3启动子结合，且SlHZ24表达水平与AsA积累呈正相关特性。相反，通过RNAi技术导致AsA表达量降低。SlHZ24同时也影响D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，说明抗坏血酸合成为多靶点调控。SlHZ24过表达植株对氧化应激的敏感性降低，作者推断SlHZ24促进抗坏血酸的合成，提高了植株对氧化应激的耐受性。
研究内容及结果
1. SlHZ24属于HD-Zip I蛋白家族
本文以维生素C合成主要途径D-mannose/L-galactose途径中关键GMP基因为切入点。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，据报道GMP家族中只有过表达SIGMP3提高了抗坏血酸的表达且改善了氧化应激耐受性。因此，本文使用酵母单杂交找寻与SIGMP3启动子作用调节抗坏血酸的转录因子，共找到25个潜在蛋白，确认SlHZ24 为研究对象。序列分析显示SlHZ24含有HD和LZ结构域（图1a），且与其他HD-Zip I蛋白高度同源（图1b）。进化分析的结果也说明SlHZ24与拟南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24属于HD-Zip I蛋白。
题目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
合作技术：EMSA
研究背景
抗坏血酸（AsA）是一种抗氧化剂，可以清除植物在胁迫条件下产生的活性氧。本文通过酵母单杂交技术、瞬时表达和EMSA实验验证了SlHZ24和SIGMP3启动子结合，且SlHZ24表达水平与AsA积累呈正相关特性。相反，通过RNAi技术导致AsA表达量降低。SlHZ24同时也影响D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，说明抗坏血酸合成为多靶点调控。SlHZ24过表达植株对氧化应激的敏感性降低，作者推断SlHZ24促进抗坏血酸的合成，提高了植株对氧化应激的耐受性。
研究内容及结果
1. SlHZ24属于HD-Zip I蛋白家族
本文以维生素C合成主要途径D-mannose/L-galactose途径中关键GMP基因为切入点。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，据报道GMP家族中只有过表达SIGMP3提高了抗坏血酸的表达且改善了氧化应激耐受性。因此，本文使用酵母单杂交找寻与SIGMP3启动子作用调节抗坏血酸的转录因子，共找到25个潜在蛋白，确认SlHZ24 为研究对象。序列分析显示SlHZ24含有HD和LZ结构域（图1a），且与其他HD-Zip I蛋白高度同源（图1b）。进化分析的结果也说明SlHZ24与拟南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24属于HD-Zip I蛋白。
2. 酵母双/单杂交验证SlHZ24反式激活作用
使用酵母双杂交实验验证了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的实验组可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生长，而对照组不能生长（图2a）。使用酵母单杂交实验验证了不同长度SlHZ24和SIGMP3启动子的作用，其中SlHZ24全长、N3、N4、N5、N6、N7包含HD结构域表现为正常生长，N1不包含HD结构域表现为细胞不生长，N2包含不完整的HD结构域表现为生长缓慢，说明HD结构域为互做结构域（图2a）。
使用酵母双杂交实验验证了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的实验组可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生长，而对照组不能生长（图2a）。使用酵母单杂交实验验证了不同长度SlHZ24和SIGMP3启动子的作用，其中SlHZ24全长、N3、N4、N5、N6、N7包含HD结构域表现为正常生长，N1不包含HD结构域表现为细胞不生长，N2包含不完整的HD结构域表现为生长缓慢，说明HD结构域为互做结构域（图2a）。
3. 瞬转及双萤光素酶检测验证SlHZ24与SlGMP3启动子结合
将SlGMP3启动子分成4段进行双萤光素酶检测实验（图3a、3b），P1和P2启动子区域检测到荧光增强，实验结果说明SlHZ24结合SlGMP3启动子的第二段序列，即-2411到-2313bp为结合区段。
将SlGMP3启动子分成4段进行双萤光素酶检测实验（图3a、3b），P1和P2启动子区域检测到荧光增强，实验结果说明SlHZ24结合SlGMP3启动子的第二段序列，即-2411到-2313bp为结合区段。
4．进一步实验验证SlHZ24和SlGMP3结合
使用酵母单杂交实验验证不同的SlGMP3启动子和SlHZ24的结合情况（图4a），结果显示SlHZ24蛋白与SlGMP3启动子的结合位点为-2411到-2313bp，突变实验也证明了这个结果（图4b）。EMSA实验进一步证明了该结论（图4c）。这些结果表明SlHZ24直接与SlGMP3的上游元件结合来启动下游表达。
使用酵母单杂交实验验证不同的SlGMP3启动子和SlHZ24的结合情况（图4a），结果显示SlHZ24蛋白与SlGMP3启动子的结合位点为-2411到-2313bp，突变实验也证明了这个结果（图4b）。EMSA实验进一步证明了该结论（图4c）。这些结果表明SlHZ24直接与SlGMP3的上游元件结合来启动下游表达。
5. 不同番茄组织及转基因番茄中SlGMP3和SlHZ24检测
使用qPCR对番茄不同组织中的SlGMP3启动子和SlHZ24的表达量进行了检测，发现两者都在茎和叶总的表达量较高（图5a），说明SIHZ24正向调节SlGMP3表达。为了验证SlHZ24对SlGMP3的影响，分别建立的SlHZ24过表达和干扰转基因番茄进行下一步实验（图5b）。
使用qPCR对番茄不同组织中的SlGMP3启动子和SlHZ24的表达量进行了检测，发现两者都在茎和叶总的表达量较高（图5a），说明SIHZ24正向调节SlGMP3表达。为了验证SlHZ24对SlGMP3的影响，分别建立的SlHZ24过表达和干扰转基因番茄进行下一步实验（图5b）。
6. SIHZ24通过调节SlGMP3表达来改变AsA的合成
对过表达、干扰番茄叶及果实中AsA的检测（图6a 、6b）实验，说明SlHZ24在番茄叶和果实中同时调节抗坏血酸的合成。过表达SlHZ24的OX-13植株果实中SlGMP3基因的表达量明显高于野生型，而干扰SlHZ24的KD-9植株果实中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6d）。有趣的是在干扰SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量显著减少，而过表达SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6c）。对转基因番茄中其他GMP家族基因的检测结果说明SlHZ24可能调节多种SIGMP基因（图6c、图6d）。
对过表达、干扰番茄叶及果实中AsA的检测（图6a 、6b）实验，说明SlHZ24在番茄叶和果实中同时调节抗坏血酸的合成。过表达SlHZ24的OX-13植株果实中SlGMP3基因的表达量明显高于野生型，而干扰SlHZ24的KD-9植株果实中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6d）。有趣的是在干扰SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量显著减少，而过表达SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6c）。对转基因番茄中其他GMP家族基因的检测结果说明SlHZ24可能调节多种SIGMP基因（图6c、图6d）。
7. 番茄中AsA和SlGMP3检测
为了检测番茄果实成熟过程中SIHZ24如何影响SIGMP3对不同时期果实的AsA和SlGMP3表达量进行了检测（图7a、7b），结果表明SlHZ24在番茄成熟的过程中可以调节SlGMP3的表达，其中以破色期果实调控效应最为显著，除了红果实成熟期。
为了检测番茄果实成熟过程中SIHZ24如何影响SIGMP3对不同时期果实的AsA和SlGMP3表达量进行了检测（图7a、7b），结果表明SlHZ24在番茄成熟的过程中可以调节SlGMP3的表达，其中以破色期果实调控效应最为显著，除了红果实成熟期。
8. SlHZ24转基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达检测
使用qPCR对番茄的叶和果实进行了检测（图8a、8b），结果表明在野生型和转基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表达量发生了改变，显示SlHZ24的多点协同调控作用。
使用qPCR对番茄的叶和果实进行了检测（图8a、8b），结果表明在野生型和转基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表达量发生了改变，显示SlHZ24的多点协同调控作用。
9. SIGME2、SIGGP启动子实验
使用EMSA实验验证转录因子SlHZ24和启动子SIGME2、SIGGP有互做关系。
使用EMSA实验验证转录因子SlHZ24和启动子SIGME2、SIGGP有互做关系。
10. SlHZ24光响应及氧化应激的作用
为了研究光对AsA的作用，作者对不同光处理番茄中的AsA和SIHZ24的表达量进行了检测（图10a、10b），结果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表达也随之提高。使用MV对转基因番茄进行处理，同时对叶绿素和MDA浓度进行检测，说明SIHZ24过表达可以提高植物对氧化应激的耐受性。
为了研究光对AsA的作用，作者对不同光处理番茄中的AsA和SIHZ24的表达量进行了检测（图10a、10b），结果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表达也随之提高。使用MV对转基因番茄进行处理，同时对叶绿素和MDA浓度进行检测，说明SIHZ24过表达可以提高植物对氧化应激的耐受性。
文章小结
目前植物合成AsA基础途径已经明确，但对AsA合成代谢的调控机制知之甚少。本文研究了番茄转录因子SlHZ24结合SIGMP3启动子从而增加AsA表达水平的机制，进而提高植物对氧化应激的耐受性。AsA（又称维生素C），是生物体一类小分子抗氧化剂物质，能清除体内活性氧，增强有机体抗氧化能力，保证新陈代谢的正常进行。不过人类自身不能合成维生素C，必须从食物中摄取。本研究首次发现调控果实AsA积累的转录因子，对揭示AsA调控机制和未来品质改良具有重要意义。
解析文献
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
参考文献
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.
目前植物合成AsA基础途径已经明确，但对AsA合成代谢的调控机制知之甚少。本文研究了番茄转录因子SlHZ24结合SIGMP3启动子从而增加AsA表达水平的机制，进而提高植物对氧化应激的耐受性。AsA（又称维生素C），是生物体一类小分子抗氧化剂物质，能清除体内活性氧，增强有机体抗氧化能力，保证新陈代谢的正常进行。不过人类自身不能合成维生素C，必须从食物中摄取。本研究首次发现调控果实AsA积累的转录因子，对揭示AsA调控机制和未来品质改良具有重要意义。
解析文献
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
参考文献
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.