1.CA4-FeAlg/HCQ纳米颗粒的制备与表征

CA4-FeAlg/HCQ的制备过程如图1A所示。按图2A步骤合成Alg-CA4偶联物，图2B表明CA4成功连接到Alg分子上。CA4是通过新的酯键合成，成功接至Alg骨架上（图2C）。制备的Alg-CA4可通过核磁共振氢谱进一步研究其化学结构（图2D）。TEM直观显示CA4-FeAlg纳米凝胶的形态为类球形，尺寸分布相对均匀（图2E、F）。CA4-FeAlg平均水合粒径约为150nm（图2G）。以Fe³⁺为交联剂合成的CA4-FeAlg平均电位值从-21.9mV变为9.23mV（图2H）。

选择自噬抑制剂HCQ作为联用药物协同治疗肿瘤。将CA4-FeAlg冻干粉在HCQ溶液中缓慢溶胀，更多的HCQ分子随着水分子进入纳米凝胶网络中。如图2I所示，投药比为1:2是最优制备条件。CA4-FeAlg/HCQ纳米凝胶的粒径分布范围依然较窄，最终水合粒径为165nm（图2J）。在进一步载药后，CA4-FeAlg/HCQ的平均电位值也由9.23mV变为-13.1mV（图3A）。

2.药物释放能力的评估

研究者采用pH7.4+10%BSA溶液模拟血液生理环境。在这种介质溶液中，48h内只有17%的CA4从CA4-FeAlg中释放出来（图3B）。此外由释放曲线可知，CA4的释放具有pH依赖性（图3B）。与在pH5.5介质溶液中相比，置于pH7.4介质溶液中（模拟肿瘤血管环境）的CA4释放速率更快，其累积释药百分率在12h内甚至达到92.12%（图3C）。CA4释放后的纳米凝胶仍保留原始结构（图3D），与直接合成的FeAlg结构并无明显差异（图3E）。这一结果说明，CA4-FeAlg纳米凝胶在血液循环过程中可以稳定存在，而在肿瘤血管处CA4可以快速释放出来。

接下来，用同样的方法评估了HCQ在CA4-FeAlg/HCQ体系中的释放特性（图3F）。从图3F可以看出，HCQ在有GSH存在的介质中释放速度明显加快。这一现象归因于在GSH的还原条件下，纳米凝胶中的Fe³⁺被还原为Fe²⁺，Fe²⁺与Alg的亲和作用降低，纳米凝胶自外而内进行解离，从而实现HCQ的有效释放。在弱酸性环境中（pH5.5+5mM GSH，模拟肿瘤细胞）这种现象表现更明显，24h时HCQ的累积释药率可达到95.07%，而pH7.4+10%BSA介质中HCQ释放较慢。以上结果表明，CA4-FeAlg/HCQ递药体系在血液和正常组织中能够保持相对稳定，而蓄积到肿瘤部位后CA4和HCQ可在各个靶向位点连续释放。

3.细胞摄取和溶酶体共定位

如图4A所示，FeAlg纳米凝胶可被A549细胞高效摄取，实现药物的有效递送。为了进一步探索FeAlg在细胞内的分布，利用LSCM对纳米凝胶与细胞器的共定位现象进行了可视化研究。如图4B所示，由于游离FITC无法进入A549细胞，视野中未发现绿色荧光，FeAlg/FITC组在共孵育0.5h时，胞质内首先观测到微弱的绿色荧光，荧光灰度值显示FeAlg与溶酶体的平均共定位系数为0.15±0.03。随着培养时间的推移，细胞中的绿色荧光也在一直不断增多并且逐渐聚集于溶酶体，在1h和3h时，平均共定位系数分别增加到0.49±0.07和0.74±0.09。以上结果显示溶酶体可能成为FeAlg/HCQ纳米凝胶递药系统发挥抗肿瘤作用的有效靶点。

4.溶酶体损伤与自噬抑制

当纳米凝胶被肿瘤细胞摄取并蓄积在溶酶体内后，Fe³⁺在高GSH作用下转化为Fe²⁺，在这种特殊的微环境中Fe²⁺又可与瘤内H₂O₂引起“芬顿”反应生成•OH（图5A），导致溶酶体破裂，从而使自噬溶酶体的形成及降解受到严重阻碍。药物处理6h后，细胞内pH变化趋势如图5B所示。与空白组相比，HCQ和CA4-FeAlg/HCQ组的荧光信号明显增强，表明细胞内pH值显著升高。

为了研究•OH和pH值变化对溶酶体稳定性的影响，用LSCM记录溶酶体的变化情况。如图5C和图5D所示，空白对照组中所有细胞的溶酶体形态完整，联合•OH和pH升高对溶酶体的破坏效应，CA4-FeAlg/HCQ处理组中平均荧光密度骤降至25.44，仅为对照组的2.28%。由此表明，FeAlg和HCQ可以共同作用于溶酶体。

接下来，作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在缺乏营养时，对肿瘤细胞自噬水平的影响。图5E显示，与DMEM组相比，在EBSS组中出现了显著的LC3蛋白的阳性自噬体。HCQ和CA4-FeAlg/HCQ处理后，细胞内的LC3蛋白表达均显著增加。这是因为营养缺乏诱导细胞自噬后，•OH引起的溶酶体膜的不稳定和HCQ引起的溶酶体酸性环境的破坏可以协同抑制自噬小体的降解，导致大量自噬体的积累。LC3-II:LC3-I值也为证明CA4-FeAlg/HCQ通过抑制自噬引起自噬体累积提供了依据。以上结果表明，CA4-FeAlg/HCQ在无营养情况下能有效抑制肿瘤细胞自噬。

5.体外肿瘤深部渗透与细胞毒性

通过体外模拟TME，研究CA4-FeAlg纳米凝胶的形态变化。在pH6.5，20μM GSH的介质中，CA4-FeAlg已经明显解体为小纳米凝胶，水合粒径减小为27nm左右（图6A）。而当酸性变强，GSH浓度增加后，CA4-FeAlg纳米凝胶自外向内解离，发生了相重构，大多数纳米凝胶的粒径变得更小甚至溶解（图6B）。这是因为FeAlg纳米凝胶的交联剂Fe³⁺可以被GSH迅速还原为Fe²⁺。Fe²⁺与Alg的相互作用较弱导致FeAlg结构从外向内解离。

研究者利用3DMCS模型考察体外深部渗透效果。如图6C表明SiO₂纳米粒子很难扩散到肿瘤深部。而在80μm深度时，FeAlg/FITC组中有强烈的绿色荧光分布在肿瘤球的中央区域。120μm深度时，FeAlg/FITC+10mM GSH组中有更多的绿色荧光分布于肿瘤球的中央范围内，其相对荧光强度是SiO₂/FITC组的12倍。图6D显示，FeAlg/FITC+10mM GSH组的相对荧光强度均高于其他两组。以上结果表明FeAlg纳米凝胶分裂成小的纳米颗粒后，利于实现肿瘤的深部渗透。

CA4-FeAlg和CA4-FeAlg/HCQ的细胞毒性明显集中，呈一定的时间依赖性（图6E和F）。选择CA4前药CA4P作为阳性对照组。CA4-FeAlg组的细胞抑制率均明显高于CA4P组，表明CA4-FeAlg纳米凝胶可作为CA4前药用于肿瘤治疗。此外，如图6F所示，CA4-FeAlg/HCQ对A549细胞的毒性最强。当药物浓度为20μg/mL，作用时间为48h时，CA4-FeAlg/HCQ组的细胞抑制率甚至达到93.86±4.78%。此外，观察CA4-FeAlg/HCQ组的活细胞数（绿色）最少（图6G）。基于以上结果，CA4-FeAlg/HCQ可在体外有效杀伤A549肿瘤细胞。

6.体内肿瘤的靶向性与穿透性

如图7A所示，游离的IR783广泛分布于裸鼠体内，并在体内被迅速清除。随着时间的延长，肿瘤内的荧光信号大幅度减弱。而FeAlg/IR783和CA4-FeAlg/IR783组肿瘤区域的荧光信号都在逐渐增加，在8h时达到最高。随后，FeAlg/IR783组肿瘤内的荧光强度迅速下降，24h时仅存在微弱荧光。然而，CA4-FeAlg/IR783在24h仍有较强的荧光。体外成像结果（图7B）显示游离IR783主要在肝、肾组织内分布，FeAlg/IR783主要存在于肝组织，肾、肺和肿瘤组织中也有少量分布。CA4-FeAlg/IR783主要存在于肿瘤组织，这归因于CA4与β-微管蛋白上的秋水仙碱受体结合。以上结果进一步证明CA4-FeAlg/IR783具有优异的肿瘤靶向性，有助于药物在肿瘤部位大量蓄积。

作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在肿瘤组织内的深部穿透性能。如图7C和7D所示，粒径稳定的SiO₂/FITC肿瘤组织穿透性较差，主要分布在肿瘤血管周围。然而，FeAlg/FITC组中的穿透距离显著增大。上述结果均表明CA4-FeAlg可以将治疗药物高效递送至肿瘤部位，并均匀渗透到实体瘤组织中。

7.体内抗肿瘤效果和安全性评价

为了系统性评价CA4-FeAlg/HCQ的抗癌性能，作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在A549荷瘤裸鼠体内的抗肿瘤作用。如图7E所示，N.S.组的相对肿瘤体积一直在升高，最终达到1.96±0.17。CA4P对肿瘤生长有一定程度的抑制作用，但肿瘤体积波动较大。相比之下，CA4-FeAlg能够显著抑制A549肿瘤的生长，揭示CA4-FeAlg作为新型的CA4前药具有良好的抗肿瘤效果。CA4-FeAlg/HCQ的治疗效果最佳，治疗终点时的肿瘤体积最小（图7F）。CA4-FeAlg/HCQ的最佳抗肿瘤作用可能来源于以下三个机制：其一，CA4破坏肿瘤血管系统切断外源性营养供应，肿瘤细胞发生坏死；其二，FeAlg通过响应TEM生成ROS产生细胞毒性；其三，CA4诱导的自噬被HCQ抑制，阻断肿瘤细胞的内源性营养通道。接下来，研究者逐一验证了这些可能的机制。

如图8A所示，N.S.组中的肿瘤血管相对完整、丰富。然而，CA4P组中的肿瘤血管密度明显降低。在CA4-FeAlg组，肿瘤血管数量最少，细胞之间的空隙也变大。接下来，作者对肿瘤细胞内的•OH含量进行了测定。实验结果表明（图8B），FeAlg给药组的肿瘤细胞中•OH含量明显增加，荧光强度是N.S.组的3.58倍。由此表明，FeAlg在肿瘤细胞中可以通过芬顿反应高效快速的产生大量•OH。研究者采用免疫组化与TEM表征对CA4-FeAlg/HCQ抑制肿瘤细胞自噬的情况进行考察。如图8C所示，与N.S.和CA4-FeAlg组相比，HCQ和CA4-FeAlg/HCQ组自噬相关蛋白LC3表达明显升高，其中以CA4-FeAlg/HCQ组表达水平最高。此外，TEM结果（图8D）也证明，经CA4-FeAlg/HCQ处理后的肿瘤细胞中显著存在大量累积的自噬泡（黄色箭头指示）。这再次提示CA4-FeAlg抗血管治疗诱导的自噬可被HCQ有效抑制，从而实现抗血管与自噬抑制协同治疗肿瘤的目的。

研究者记录了治疗期间荷瘤小鼠的体重。如图8E所示，各组之间的荷瘤鼠体重没有发生急剧下降的现象，治疗期间的变化趋势基本相同，没有显著性差异，说明CA4-FeAlg/HCQ纳米凝胶相对安全，毒副作用较小。各组心、肝、脾、肺、肾、脑组织均无明显病理改变，进一步证明了CA4-FeAlg/HCQ的生物安全性。